本发明公开了一种用于籼粳亚种广亲和育性位点片段聚合的分子标记引物组合及其应用。该引物组合由分别对育性位点S5-n位点、S7-n位点和S17-n位点的分子标记引物W5、W7和W17组成,其中,W5的左端引物序列为SEQ ID NO.1,右端引物序列为SEQ ID NO.2;W7的左端引物序列为SEQ ID NO.3,右端引物序列为SEQ ID NO.4;W17的左端引物序列为SEQ ID NO.5,右端引物序列为SEQ ID NO.6。本发明所述的分子标记引物组合在杂交育种中的应用。适合于水稻籼粳交后代广亲和育性位点片段聚合系的选育,可解决籼粳交亚种间杂种不育的问题,促进籼粳亚种间杂种优势的利用。
1.籼粳亚种广亲和育性位点片段聚合的分子标记方法,其特征在于,用分子标记引物W5、W7和W17分别对育性位点S5-n位点、S7-n位点和S17-n位点的广亲和育性片段通过分子标记选择来聚合,其中用分子标记引物W5xa0:左端引物序列xa0SEQxa0IDxa0NO.1,右端引物序列xa0SEQxa0IDxa0NO.2扩增广亲和水稻品种DNA,获得S5-n位点标记片段大小为105bp;扩增籼稻品种DNA,获得S5-i位点标记片段大小为145bp;扩增粳稻品种DNA,获得S5-j位点标记片段大小为131bp;用分子标记引物W7xa0:左端引物序列SEQxa0IDxa0NO.3,右端引物序列xa0SEQxa0IDxa0NO.4扩增广亲和品种DNA,获得S7-n位点标记片段有2条带,大小分别为140bp和175bp;籼稻品种DNA,获得S7-i位点标记片段大小为150bp;扩增粳稻品种DNA,获得S7-j位点标记片段有2条带,大小分别为140bp和150bp;用分子标记引物W17xa0:左端引物序列SEQxa0IDxa0NO.5,右端引物序列xa0SEQxa0IDxa0NO.6扩增广亲和品种DNA,获得S17-n位点标记片段大小为200bp;扩增籼稻品种DNA,获得S17-i位点标记片段大小为180bp;扩增粳稻品种DNA,获得S17-j位点标记片段有2条带,大小分别为180bp和190bp。
2.一种用于籼粳亚种广亲和育性位点片段聚合的分子标记引物组合,其特征在于由分子标记引物W5、W7和W17组成,其中,分子标记引物W5、W7和W17分别对育性位点S5位点、S7位点和S17位点,分子标记引物W5的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.1,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.2;分子标记引物W7的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.3,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.4;分子标记引物W17的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.5,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.6。
3.权利要求2所述的分子标记引物组合在杂交育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于权利要求2所述的分子标记引物组合在聚合多个广亲和基因的水稻品种的选育中的应用。技术领域
本发明属于分子遗传学领域,提供了一种用于籼粳亚种广亲和育性位点片段聚合的分子标记引物组合及其应用。
背景技术
近年来,随着我国人口数量的不断增加,以及耕地面积有限的情况下,提高水稻单产对保障国家粮食安全具有重要意义,而籼粳杂种优势的利用是提高水稻单产的重要途径。但籼粳亚种间杂种F1通常表现部分不育,从而限制其强大杂种优势在生产上的有效利用。广亲和基因S5-n的发现为克服籼粳亚种间育性障碍提供了途径(Japan.J.Breed.,1984,34:304-312)。目前,广亲和基因S5-n被广泛应用于水稻籼粳杂种优势利用中(Scixa0Agricxa0Sin1992,23:1-6)。随着育种亲本范围的扩大,研究者们发现,某些杂交组合尽管亲本之一为携带S5-n的广亲和品种,但其杂种F1仍出现半不育现象(Japanxa0Jxa0Breed1993,43:507–516),因此仅靠广亲和基因S5-n并不能完全解决籼粳亚种间的杂种半不育性问题。在育种实践中,随着杂种育性鉴定范围的扩大,鉴定出了S7(Japanxa0Jxa0Breed1992,42:793–801)、S8(Japanxa0Jxa0Breed1993,43:507–516)、S9(Theorxa0Applxa0Genet,1996,92:183-190)、S15(Theorxa0Applxa0Genet,1996,92:183-190)、S16(Breedingxa0Science1995,45:161-170)、S17(Breedingxa0Science1995,45(2):191-195)、S29(Plantxa0Breeding,2005,124:440-445)、S30(Breedxa0Science,2005,55:409-414)、S31(Euphytica,2006,151:331-337)和S32(Theorxa0Applxa0Genet,2007,114:515–524)等杂种雌配子不育位点。目前,怎样利用已经发现的育性位点,特别是广亲和育性位点应用于水稻籼粳交分子标记育种还是一片空白。基于水稻籼粳交杂种不育的机理主要是单位点孢子体-配子体互作模式(IRRIRicexa0genetics.IRRI,Manila,1984,pp119–130),及在某一个育性位点上,籼稻和粳稻和广亲和品种中的等位基因分别为SX-i、SX-j和SX-n。基因型为SX-i/SX-j的杂合体由于携带SX-j的雌配子部分败育而产生半不育小穗。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供一种籼粳杂种育性位点广亲和片段聚合的分子标记方法。本发明的另一目的是提供用于籼粳亚种广亲和育性位点片段聚合的分子标记引物组合。本发明的又一目的是提供所述的分子标记引物组合在杂交育种中的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现:籼粳杂种育性位点广亲和位点片段聚合的分子标记方法,用分子标记引物W5、W7和W17分别对育性位点S5-n位点、S7-n位点和S17-n位点的广亲和育性片段通过分子标记选择来聚合,其中用标记引物W5左端引物序列5’-AATGGAGTCGACCGTGTGTTCGTCG-3"(SEQxa0IDxa0NO.1)右端引物序列5"-CCCCAAACCTGAAATCACCAGTGTT-3"(SEQxa0IDxa0NO.2)扩增广亲和水稻品种DNA,获得S5位点标记片段大小为105bp;扩增籼稻品种DNA,获得弱位点标记片段大小为145bp;扩增粳稻品种DNA,获得S5位点标记片段大小为131bp;标记引物W7左端引物序列5’-TTCAGCCTCGTATCGCTCCTA-3’(SEQxa0IDxa0NO.3)右端引物序列5’-TGCTATCCTGGTTGCTCTGCT-3’(SEQxa0IDxa0NO.4)扩增广亲和品种DNA,获得S7位点标记片段有2条带,大小分别为140bp和175bp;扩增籼稻品种DNA,获得S7位点标记片段大小为150bp;扩增粳稻品种DNA,获得S7位点标记片段有2条带,大小分别为140bp和150bp;标记引物W17左端引物序列5’-GGTATCCATAATCTCCACAAC-3’(SEQxa0IDxa0NO.5)右端引物序列5’-CTTTCTACATGACGATGAACA-3’(SEQxa0IDxa0NO.6)扩增广亲和品种DNA,获得S17位点标记片段大小为200bp;扩增籼稻品种DNA,获得S17位点标记片段大小为180bp;扩增粳稻品种DNA,获得S17位点标记片段有2条带,大小分别为180bp和190bp。一种用于籼粳亚种广亲和育性位点片段聚合的分子标记引物组合,该引物组合由分子标记引物W5、W7和W17组成,其中,分子标记引物W5、W7和W17分别对育性位点S5-n位点、S7-n位点和S17-n位点,分子标记引物W5的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.1,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.2;分子标记引物W7的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.3,右端引物序列为SEQxa0IDNO.4;分子标记引物W17的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.5,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.6。本发明所述的分子标记引物组合在杂交育种中的应用。本发明所述的分子标记引物组合优选在聚合多个广亲和基因的水稻品种的选育中的应用。所述分子标记方法的应用,进一步包括如下方法:(1)以高产籼稻恢复系镇恢129(杂交水稻,2000,15(4):8-9)为母本,和高抗白叶枯病的抗63(杂交水稻,2005,20(1):11-14,专利号ZL92103511X,证书号30184,http://www.uast.com.cn/njnd/pzzs/pzzsdetail.asp?Varid=108)杂交得F1种子,冬季把F1种子带海南加代,再与带有粳稻广亲和品种02428血缘的R437(中国水稻信息网C.NRRI>保护新品种R6547http://www.chinariceinfo.com/variety/baohu/20041008)复交,在分离三交群体中,分别用S5位点的标记W5;S7位点的标记W7;S17位点的标记W17进行检测。在分离群体中只要带有这3个位点的片段,同时包含杂合片段,都在当季收种。在随后的每一个世代中,都用同样的方法进行检测,一直到复交CF8世代得到一个基本稳定的籼稻恢复系材料W8733,即镇恢129/抗63//R437(CF8)。(2)以籼稻恢复系材料W8733作育种材料进一步自交,发现株系W107表现稳定整齐一致,株型好,同时分别用S5-n位点的标记W5;S7-n位点的标记W7;S17位点的标记W17进行检测,都带有S5-n位点、S7-n位点和S17-n位点的片段。将该株系暂定名为恢复系W107。用W107作父本与不育系II-32A和协青早A等成对测交,其对应的杂交种也稳定一致,优势强,丰产性好。以W107为父本制的II优107和协优107杂交种,在杂交籼稻区试中,比对照汕优63增产6.98%,增产极显著。协优107参加国家长江中下游杂交籼稻优质组区试,比对照汕优63增产7.34%,极显著,第二年继续试验,同时破格进入生产试验。杂交组合强大的杂种优势表明W107是一个强优势的恢复系。恢复系W107可以与籼稻、粳稻以及育种上正在利用的常规品种配制杂交种应用。有益效果本发明所提供的籼粳杂种广亲和育性位点片段聚合的分子标记方法,具有以下优点:(1)通过本发明获得与籼粳杂交广亲和育性位点紧密连锁的分子标记,在S5-n位点上开发分子标记W5,在S7-n位点上开发分子标记W7,在S17-n位点上开发分子标记W17。(2)通过本发明可对S5-n、S7-n、S17-n育性位点进行广亲和片段聚合进行分子标记,选择的片段位置明确,鉴定方便。通过检测广亲和育性位点的分子标记,即可预测籼粳交杂种育性恢复的大小,进而在籼粳交分离群体中快速筛选出高育的后代用于杂交水稻的育种。该方法检测方便快速,不受环境影响;该方法适合于水稻籼粳交广亲和育性位点片段聚合系的选育,可解决籼粳交亚种间杂种不育的问题,促进籼粳亚种间杂种优势的利用。(3)辅助育种选择目标明确,节约成本,能够快速选育强大优势的恢复系。在籼粳交传统育种方法中,首先要种植较大的次级分离群体,需要投入大量的人力,物力和财力。其次,育种的周期长,一个常规品种的选育需要8-10年,且不一定在育性位点选育到纯合稳定的植株。而通过早期的育性位点的分子标记选择,可以在较小的分离群体中,通过检测籼粳交育性位点的分子标记,在苗期就鉴定出聚合片段的单株,淘汰其它植株,不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。通过此方法,强优恢复系W107只用了6年时间就被选育出来了,较常规的育种方法提前2年时间。成功用于与不育系配制杂交组合,后代表现出强大的籼粳交杂种优势,如协优107参加国家长江中下游杂交籼稻优质组区试,比对照汕优63增产7.34%,极显著,第二年继续试验,同时破格进入生产试验。
附图说明
图1在S5位点分子标记W5检测籼稻、粳稻和广亲和品种M为Marker,1,7,8,9,10,11,12泳道代表亲本镇恢129片段的单株;3,6为带有亲本品种抗63片段的单株;2,4,5泳道为带有广亲和品种R437片段的单株。图2在S7位点分子标记W7检测籼稻、粳稻和广亲和品种M为Marker,2,3,4,5,10为带有镇恢129片段的单株;6,9泳道为带有亲本品种抗63片段的单株;1,7,8,11,12泳道为带有广亲和品种R437片段的单株。图3在S17位点分子标记W17检测籼稻、粳稻和广亲和品种M为Marker,2,5,6为带有镇恢129片段的单株;4,7,8,10泳道为带有亲本品种抗63片段的单株;1,3,9,11,12泳道为带有广亲和品种R437片段的单株。图4在S5、S7、S17位点分别用分子标记W5、W7、W17检测W107聚合广亲和位点片段M为Marker,2,4,6,13,19,20,23,24,26,29,31,32为带有W107片段的单株。图5强优恢复系W107与对照镇恢084成熟时期穗型的比较,以及与亲本镇恢129粒形的比较。
具体实施方式
研究结果表明籼粳交杂种不育的机理属于单位点孢子体-配子体互作模式,及在某一个育性位点上,籼稻和粳稻中的等位基因分别为SX-i和SX-j,基因型为SX-i/SX-j的杂合体由于携带SX-j的雌配子部分败育而产生半不育小穗。但是广亲和品种与籼稻、粳稻品种杂交,基因型分别为SX-n/SX-i和SX-n/SX-i,杂合体由于携带SX-n亲和基因从而表现可育。因此,在育性位点上聚合多个广亲和等位基因位点,这样才能克服籼粳交杂种不育的难题。其中,本发明已经对S5,S7和S17育性位点进行了精细定位,相应的分子标记也已经开发。如分子标记引物W5的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.1,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.2;分子标记引物W7的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.3,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.4;分子标记引物W17的左端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.5,右端引物序列为SEQxa0IDxa0NO.6。(一)标记筛选:用籼稻品种镇恢129与抗63杂交得F1种子,并与恢复系R437(R437作父本)杂交,恢复系R437带有粳稻广亲和品种02428血缘(中国稻米,2004)。在分离三交群体中,同时用S5位点的标记W5;S7位点的标记W7;S17位点的标记W17进行检测。在分离群体中只要带有这3个位点广亲和位点的片段(包含杂合片段),都在当季收种用于下一季的自交分离。用分子标记W5扩增时,能得到S5位点标记105bp大小的片段,用分子标记W7扩增时,获得S7位点标记片段有2条带,分别为140bp和175bp大小的片段,用分子标记W17扩增时,能得到S17位点标记的200bp大小的片段(见表1)。在随后的每一个世代中,都用同样的方法进行检测,同时兼顾产量性状、抗性和品质等其他农艺性状,一直到复交CF8世代得到一个基本稳定的籼稻恢复系材料W8733,即镇恢129/抗63//R437(CF8)。(2)以籼稻恢复系材料W8733作育种材料进一步自交,发现株系W107表现稳定整齐一致,株型好,同时用3个广亲和位点检测,都带有S5-n位点、S7-n位点和S17-n位点的片段,将该株系暂定名为恢复系W107(见图4)。用恢复系W107与籼稻、粳稻和其它生产上应用的常规品种杂交,其杂交组合均表现良好的亲和性(见表2)。此外,用W107作父本与不育系II-32A和协青早A等成对测交,其对应的杂交种也稳定一致,优势强,丰产性好。以W107为父本制的II优107和协优107杂交种,在杂交籼稻区试中,比对照汕优63增产6.98%,增产极显著。协优107参加国家长江中下游杂交籼稻优质组区试,比对照汕优63增产7.34%,极显著,第二年继续试验,同时破格进入生产试验。杂交组合强大的杂种优势表明W107是一个强优势的恢复系(见表3)。表1分子标记在不同品种类型中扩增的PCR产物大小ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>(二)材料与方法:2.1品种:镇恢129(杂交水稻,2000,15(4):8-9),抗63(杂交水稻,2005,20(1):11-14,专利号ZL92103511X,证书号30184),R437(中国水稻信息网C.NRRI>保护新品种R6547http://www.chinariceinfo.com/variety/baohu/20041008),镇恢084(杂交水稻,2005,20(2):31-32),广亲和品种02428(科学通报,2005,50:32-37)。在分蘖期剪取水稻叶片,并冻存于-70°C冰箱中。利用SDS方法(Plantxa0Molxa0Bioixa0Rep,1983,1:19-21)提取基因组的DNA。提取出的DNA溶于200ulTE缓冲液中(10mMxa0Trisbase,0.1mMEDTA)。用MBA2000UV/VISSpectrometer检测样本DNA的质量。然后用双蒸水稀释成20ng/ul的工作液,储存在4°C冰箱中,分析时用作模板。PCR反应参照(Theorxa0Applxa0Genet,1997,95:553–567)的方法。95°C变性5min;95°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸1min,共进行35次循环,最后72°C延伸7min,10°C保存。PCR反应在MJxa0Reseachxa0PTC-225热循环仪中进行。反应体系包括:DNA模板约10ng,10×LAxa0buffer1μl,LAxa0Taq(5u/μl)0.1μl,MgCl2(25mM)1μl,dNTPs(2.5mM)1μl,正义、反义引物(2mM)各1.5μl,然后加ddH2O使体积到达10μl,PCR程序为:94°C4min;94°C30s,55°C30s,72°C3min,30个循环;72°C10min。扩增产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,然后按照(Biotechniques1994,17:915–919)的方法经硝酸银染色后进行分析和读数。图1为S5位点分子标记W5选择单株的电泳照片,图2为在S7位点分子标记W7检测籼稻、粳稻和广亲和品种的电泳照片,图3为在S17位点分子标记W17检测籼稻、粳稻的电泳照片2.2花粉、小穗和胚囊育性调查花粉育性调查采用I₂-KI染色法:供试材料开花前1-2天,从每个单株小穗的上中部、中部和中下部各取2朵颖花,置于乙醇:冰乙酸(3:1)溶液中固定,4°C冰箱保存。镜检时从每株的6朵颖花中各取1个花药,混样观察花粉育性,用1%I₂-KI染色、压片,10×20倍显微镜观察。每个片子观察4个视野,保证花粉粒总数在200粒以上。根据花粉染色及形态特征判断其育性(Oryza,1981,18:140-142):圆形黑褐色的花粉粒为可育,形状不规则、黄色及不染色的花粉粒为不育。花粉育性用可育花粉百分率的平均值来表示。小穗育性调查:在成熟期,每株选取3个结实率相当的单穗,考查其上半部的小穗育性;统计时,以3个单穗的平均育性作为该株的小穗育性;小穗育性是受精粒数占总粒数的百分率。从每个材料中取5株进行育性调查,以5株的花粉和小穗育性平均值作为该材料的育性值(Theorxa0Applxa0Genet,1996,92(1):183-190)。(三)结果与分析:3.1光温敏恢复系W107育性位点聚合的分子标记选育以高产恢复系镇恢129(杂交水稻,2000,15(4):8-9)为母本,和高抗白叶枯病的抗63(杂交水稻,2005,20(1):11-14,专利号ZL92103511X,证书号30184,http://www.uast.com.cn/njnd/pzzs/pzzsdetail.asp?Varid=108)杂交得F1种子,冬季把F1种子带海南加代,再与带有粳稻广亲和品种02428血缘的R437(中国水稻信息网C.NRRI>保护新品种R6547http://www.chinariceinfo.com/variety/baohu/20041008)复交,在分离三交群体中,分别用S5位点的标记W5、S7位点的标记W7、S17位点的标记W17进行检测。在分离群体中只要带有这3个位点的片段,同时包含杂合片段,都在当季收种。在随后的每一个世代中,都用同样的方法进行检测,一直到复交CF8世代得到一个基本稳定的籼稻恢复系材料W8733,即镇恢129/抗63//R437(CF8)。从恢复系材料W8733中选5株与II-32A和协青早A等生产上大面积应用的不育系成对测交,南京正季种植CF8及对应的杂种,其中株系W107表现稳定整齐一致,株型好,其对应的杂交种也稳定一致,优势强,丰产性好;同时用3个广亲和位点检测,都带有S5-n位点、S7-n位点和S17-n位点的片段,将该株系暂定名为恢复系W107。把W107带到海南种植并交叉配组制种,父本W107表现一致无分离。正季以W107为父本制的II优107和协优107参加本单位两年的杂交籼稻评比。2004年II优107参加安徽杂交籼稻区试,比对照汕优63增产6.98%,增产极显著,排第三,2005年继续参试,同时参加生产试验。协优107于2004参加国家长江中下游杂交籼稻优质组区试,比对照汕优63增产7.34%,极显著,2005年继续试验,同时破格进入生产试验。3.2强优恢复系W107与常规品种杂交F1的花粉育性和结实率调查分析在育成强优恢复系W107在S5位点的带有广亲和基因S5-n;S7位点的带有广亲和基因S7-n,S17位点的带有广亲和基因S17-n。用强优恢复系W107与典型的籼稻、粳稻以及育种上正在利用的常规品种配制杂交组合(见表3)。从表中结果可知,恢复系W107与粳稻测验种巴里拉、秋光杂交杂种的花粉育性正常,分别为97.62±0.93和88.18±4.31;小穗育性也表现为高育,分别只有55.64±2.42和62.01±3.13。恢复系W107与籼稻测验种南京11、IR36杂交杂种的花粉育性正常,分别为99.49±0.77和91.98±0.27;小穗育性也表现正常,分别达到92.77±0.61和85.35±0.77。同时,恢复系W107与大部分广亲和品种杂交杂种育性正常。该结果暗示恢复系W107在不育位点上大部分都已经聚合为多个广亲和片段,因此,与粳稻和籼稻杂交杂种育性表现正常。本发明提供了籼粳杂种广亲和育性位点片段聚合的分子标记方法,属于分子遗传学领域。开发设计的分子标记引物W5,W7和W179能够分别在S5,S7,和S17这3个籼粳交广亲和育位点扩增出差异片段。通过育性基因位点的分子标记来进行广亲和育性片段的聚合,可准确而快速的导入所需要的片段,大大提高了籼粳交广亲和育性位点片段聚合的选择效率,并利用此方法选育出强优恢复系W107(见表3)。本发明所涉及的材料均为公知公用材料:镇恢129(杂交水稻,2000,15(4):8-9),抗63(杂交水稻,2005,20(1):11-14,专利号ZL92103511X,证书号30184),R437(中国水稻信息网C.NRRI)保护新品种R6547http://www.chinariceinfo.com/variety/baohu/20041008),镇恢084(杂交水稻,2005,20(2):31-32),广亲和品种02428(科学通报,2005,50:32-37)。表2强优恢复系W107与籼稻、粳稻品种杂交杂种F1的花粉育性和小穗育性。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表3强优恢复系W107作亲本与生产上利用的不育系配制杂交组合在不同地点产量的表现情况,利用恢复系W107配制的杂交组合表现出较强的杂种优势。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="497"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>